300799[在交通银行开业股票开户的吗]在交通银行开业股票开户的吗
本文由伯小远翻译自Bio-protocol。Bio-protocol是为一线科研人员服务的期刊,其专精于遴选、宣布从根底到高档,从传统到立异的各种试验计划。
摘要
烟草(N.benthamiana)是一个用于高水平、瞬时表达蛋白的杰出体系。本protocol详细描述了如安在烟草叶片中瞬时表达蛋白和完结免疫共沉积(Co-IP)试验,适用于蛋白纯化、研讨蛋白-蛋白相互作用以及其他蛋白相关试验。
资料和试剂
1.烟草种子
2.已转入双元载体(如pCAMBIA1300、pBIN19等,靶基因带有蛋白标签,本文以3×FLAG标签作为比如)的农杆菌菌株
3.乙酰丁香酮(Sigma-Aldrich,目录号:D134406)
4.MES(pH5.6)(Sigma-Aldrich,目录号:M8250)
5.蛋白酶抑制剂(Roche,目录号:04693132001)
6.NP-40(Fluka,目录号:74385)
7.诱导培育基(见配方)
8.侵染培育液(见配方)
9.提取缓冲液(见配方)
10.TBS(见配方)
11.4×SDS(见配方)
设备
1.Anti-FLAG珠(Sigma-Aldrich,目录号:A2220)
2.3×FLAG多肽(Sigma-Aldrich,目录号:F3290)
3.蛋白G琼脂糖珠(GE,目录号:17-0618-01)
4.用于农杆菌培育的试管、摇床等
5.离心机
6.1mL打针器
过程
1.选取生善于22℃(16h光照/8h漆黑)四周龄左右的烟草。将已转入双元载体(意图基因与3×FLAG标签相连)的农杆菌菌株,在3mL含有相应抗生素的LB液体培育基中28℃、200rpm过夜培育。
2.预备诱导培育基,将LB培育基中的农杆菌接种到诱导培育基中(过夜培育物按1/100稀释,或许培育8h的培育物按1/25稀释)。可在早上预备好后当晚进行侵染,或在晚上预备好后第二天早上做侵染。
3.28℃、200rpm培育8-12h使农杆菌细胞处于对数成长期,OD=0.6-0.8。
4.将农杆菌培育物在50mL离心管中以3200×g的速度离心10min。
5.预备好侵染培育液。
6.在5-10mL的侵染培育液中重悬农杆菌沉积。
7.使农杆菌重悬液的OD=0.1-0.3,每片叶子预备1mL重悬液即可。假如你想表达两种及以上蛋白,将每种农杆菌调好OD后混合即可。关于不同的质粒,引荐先进行预试验,经过调理OD值来操控蛋白的表达量,例如用更高OD的农杆菌来表达低丰度蛋白,用更低OD的农杆菌来表达高丰度的蛋白。
8.打针前30min,对烟草植株洒水,这样能够更简单进行打针。
9.挑选适宜的叶片进行打针。挑选外观健康的叶片,不要运用破损的叶片。抱负的叶片是嫩叶,3-5cm宽,每株运用2-3片叶片。每个叶片大约0.1g,满足检测蛋白含量了。关于Co-IP试验来说,10片叶片满足了。
10.涡旋农杆菌菌液使其悬浮,运用去掉针头的1mL打针器将农杆菌菌液打针至叶片的反面,打针时动作尽量轻柔,勿损害叶片。侵染区域能够很简单辨别出来,由于其会被水渗透。假如用力推动打针器但侵染区域中止扩展,那就换个区域持续打针,只需能掩盖整个叶片即可。对侵染区域的数量并没有特殊要求,但一般每片叶子少于5个。侵染完毕后,将植株放置于原成长环境下进行培育。
11.培育36-48h后,摘取被侵染的烟草叶片。1g鲜样一般满足。假如需求检测哪个时刻点表达的蛋白含量最高,则需求进行试验确认。
12.放入研钵,用液氮研磨样品。
13.向研钵中参加提取缓冲液(见配方,2%PVPP10mMDTT1×PI1mMPMSF),每克安排加约2mL提取缓冲液,放入4℃冰箱,比及粉末开端消融,并经过研磨使混合物均质。
14.将13步中的混合物转移至1.5mLEp管中,以最高速、4℃离心10min。
15.将上清液转移至新的Ep管中,并再次离心。
16.将上清液转移至新的Ep管中,参加20%NP40至终浓度为0.15%。
17.将20μL蛋白G琼脂糖珠参加样品中,在冷室中孵育30min(珠子运用1mL提取缓冲液进行预平衡,并在12,000×g离心30s后弃上清)。
18.经过12,000×g离心30s将珠子沉积,并将上清液转移到新管中。取60μL上清作为Input样品,作为对照,表明免疫沉积前的样品。
19.在上清液中参加10μLanti-FLAG珠。珠子也需求平衡,同过程17,4°C孵育3h。
20.离心沉积珠子,取60μL上清液作为试验样品。
21.用1mL提取缓冲液(含0.15%NP40)清洗珠子3次。清洗过程是:参加1mL提取缓冲液,4°C、12,000×g离心1min来沉积珠子,丢掉上清液。
22.再参加100μL稀释的3×FLAG多肽,冷室孵育1h(在含有1mMEDTA和1×蛋白酶抑制剂的TBS中稀释3×FLAG贮存液至1/10的浓度。溶解于TBS的2.5mg/mL3×FLAG贮存液可在-20°C下贮存多年)。
23.离心以沉积珠子,将上清液转移至洁净的Ep管中。向上清液中参加35μL4×SDS上样缓冲液。该部分是含有纯化后的免疫沉积蛋白的洗脱样品。将60μL1×SDS上样缓冲液参加含有珠子的Ep管中。珠子或许含有无法洗脱的残留蛋白质。
24.在Input组和试验组样品中参加恰当体积的4×SDS加载缓冲液。将一切样品在95-100°C下煮沸5-10min。并运用蛋白质印迹剖析样品。
数据
以下为一个典型的Co-IP试验成果图。
图1Co-IP检测bHLH84-HA与SNC1-FLAG的相互作用(Xuetal.,2014)。
注:
1.在Co-IP试验中必须有阴性对照。关于单个的蛋白质免疫沉积,以表达空载体作为阴性对照。关于两种或多种蛋白的免疫共沉积,主张将不含钓饵蛋白的空载与含有猎物蛋白的相关载体一同表达。依据不同的试验设计,能够包含更多的阴性对照。
2.虽然IP的功率在不同的试验中或许略有不同,只需蛋白被拉下,免疫沉积试验就具有高度的可重复性。
配方
1.诱导培育基
2.侵染培育液
3.提取缓冲液
10%甘油
25mMTris-HCl1mMEDTA
150mMNaCl
4.TBS
10mMTris-HCl
150mMNaCl(pH7.4)
5.4×SDS
200mMTris-HCl(pH6.8)
8%SDS
40%甘油
0.04%溴酚蓝
400mMDTT
伯远生物可提供以下技术服务
Co-IP(用于验证蛋白-蛋白相互作用)
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Co-IP与信号通路研讨
References:
Moffett,P.,Farnham,G.,Peart,J.andBaulcombe,D.C.(2002).InteractionbetweendomainsofaplantNBS-LRRproteinindiseaseresistance-relatedcelldeath.EMBOJ21(17):4511-4519.
VandenAckerveken,G.,Marois,E.andBonas,U.(1996).RecognitionofthebacterialavirulenceproteinAvrBs3occursinsidethehostplantcell.Cell87(7):1307-1316.
Xu,F.,Kapos,P.,Cheng,Y.T.,Li,M.,Zhang,Y.andLi,X.(2014).NLR-associatingtranscriptionfactorbHLH84anditsparalogsfunctionredundantlyinplantimmunity.PLoSPathog10(8):e1004312.
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